紫外可见分光光度计的工作原理

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紫外可见分光光度计的工作原理
赛伦仪器 / 2014-12-23

紫外可见分光光度计是分光光度法所使用的仪器。通常，物质对200~800nm光谱区内的光具有选择性吸收。紫外可见分光光度计（分光光度法）就是根据物质对不同波长单色光的吸收程度进行定性和定量分析。

有些物质有颜色，在溶液中浓度越大，颜色越深；有些物质本身无色或颜色很浅，但能与适当的试剂发生显色反应而呈现颜色。紫外可见分光光度法就是依据物质对光的选择性吸收而进行的分析方法。

一、光的基本特性

1．光的波长和互补光

光的波长

光是一种电磁波，具有波长和频率。具有同一种波长的光称为单色光。纯单色光很难获得。通常所说的单色光也只是接近于单色光。具有多种波长的光称为复合光。我们日常所熟悉的日光、白炽灯光都是复合光。

人眼对不同波长的光的感觉是不一样的。凡是能被肉眼感觉到的光称为可见光，其波长范围为400~780nm（1nm=10⁷cm），不同波长的光刺激眼睛后会产生不同颜色的感觉。人眼不能感觉得到波长小于400nm或大于780nm的光，也就是，人们看不到这样的光。在波长小于400nm的光中，波长为10~400nm的光为紫外光，其中，波长为200~400nm的光称为近紫外光，波长为10~200nm的光称为远紫外光。波长大于780nm的光中，波长为780~10⁶nm的光为红外光，其中，波长为780~2500nm的光为近红外光，波长为2500~50000nm的光称为中红外光，波长为50000~10⁶nm的光称为远红外光。表1是各单色光的近似波长范围。

表1 各单色光的波长

		色彩	波长（nm）
日光	紫外光	无色	<400
	可见光	紫	400~450
		蓝	450~480
		青	480~490
		蓝绿	490~500
		绿	500~560
		黄绿	560~580
		黄	580~600
		橙	600~650
		红	650~780
	红外光	无色	>780

光色互补

将日常见到的一束日光或白炽灯光通过棱镜后，即可色散为红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等长色光。如果把适当颜色的两种光按一定强度比例混合，也可以成为白光。这两种颜色的光称为互补色光。例如：

紫红色光与绿色光互补；

红色光与青色光互补；

橙色光与青蓝光互补；

黄色光与蓝色光互补。

2．物质对光的选择性吸收

物质颜色的产生

当一束白光通过某透明溶液时，如果该溶液对可见光区各波长的光均不吸收，也就是说，入射光全部通过溶液，这时看到的溶液透明无色。当该溶液对可见光区各种波长的光全部吸收时，则看到的溶液呈黑色。如果溶液选择性地吸收了可见光区某波长的光，则该溶液即呈现出被吸收光的互补色光的颜色。

例如，将一束白光通过KMnO₄溶液时，溶液选择性地吸收了500~560nm的绿色光，而将其它色光两两互补成白光通过，只剩下紫红色光未被互补，所以，KMnO₄溶液呈现紫红色。

从上述现象可见，物质呈现出各种各样的颜色是由于物质对光有选择性吸收的结果。物质所呈现的颜色是被物质吸收的光的互补色。

物质的吸收光谱曲线

一种有色物质选择性地吸收哪些波长的光，可以用溶液的吸收光谱曲线来描述。吸收光谱曲线就是依次将各种波长的单色光通过这种固定浓度和厚度的有色溶液，分别测出该溶液对每一波长的光的吸收程度，即吸光度（A），然后以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，即可得到一条曲线，这条曲线描述了溶液对不同波长的光的吸收能力，称为该溶液的吸收光谱曲线，也叫吸收光谱或吸收曲线。图1是一种溶液的光吸收曲线。

由图可见，溶液对不同波长的光的吸收程度不同，其中，对某一个波长的光的吸收程度最大，为吸收曲线的最高峰处，此波长称为最大吸收波长。在实际测量中，都尽可能选用最大吸收波长。同一物质不同浓度的溶液的吸收曲线形状相似，最大吸收波长相同，在一定波长处吸光度随浓度的增加而增大，根据这个特征可对物质进行定量分析。

二、 吸收定律

根据朗伯-比耳定律，可以使用紫外可见分光光度法进行定量分析。

1．透射比与吸光度

当一束平等的单色光垂直照射到一定浓度的、均匀的吸光物质的稀溶液时，光的一部分被溶液吸收，一部分透过溶液。若入射光强度为I₀，由于溶液吸收了一部分光，通过溶液后航向光强度减少为I；把透射光强度与入射光强度的比值称为透光度或透光率，也称为透射比。用“T”表示（有的文献用“τ”表示）：T=I/ I₀。

在分光光度法中，还使用T的倒数的对数表示溶液对光的吸收程度，称之为吸光度A。

2．吸光度与溶液浓度

当一束平行单色光垂直入射通过一定光程的均匀稀溶液时，溶液的吸光度A与吸光物质浓度及光程长度的乘积成正比。这就是朗伯-比耳定律，也称为光吸收定律。公式表示如下：

A=lg(I/ I₀)=εbc

其中：ε为有色溶液在浓度c=1mol/L，光程b=1cm时的吸光度。它是各种有色物质在一定波长下的特征常数，ε值越大，表示该有色物质对此波长光的吸收能力越强。b为光程，即光通过比色皿内溶液的距离，单位为cm。c为有色溶液的浓度，单位为mol/L。当光程b为固定值（例如1cm或2cm）时，吸光度A与溶液浓度c成正比关系。

吸光度A只是一个相对值，在实际分析工作中，常用标准曲线法确定溶液浓度。具有做法是先配制一系列浓度已知的待测物标准溶液，分别加入试剂显色（若物质在紫外光区有吸收，并且测定也在紫外区进行，可不必显色，待测样品也如此），测定各标准溶液的吸光度A，在坐标纸上绘制出标准溶液的吸光度A与浓度c的标准曲线（A-c的标准曲线应是一条直线），将待测试液同样显色，在相同操作条件下测定待测试液的吸光度A_x，则可由A_x在标准曲线图上查得对应的试液浓度C_x。

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